1. Внутриканальное введение DRibbles генерирует превосходную антиген-специфическую активацию и экспансию...
2. Перекрестное праймирование 4T1-специфических Т-клеток DRibbles, выделенных из аллогенных опухолевых клеток
3. Лечение мышей с установленными опухолями 4T1 интранодальным введением аутологичных и аллогенных DRibbles...
4. SLiP, выделенные из опухолевых клеток, эффективно стимулируют антиген-специфические наивные Т-клетки in vitro
5. Классические ограниченные по МНС I противоопухолевые Т-клетки можно индуцировать in vivo путем иммунизации...

Внутриканальное введение DRibbles генерирует превосходную антиген-специфическую активацию и экспансию Т-клеток

Мы продемонстрировали, что DRibbles, выделенные из ряда клеточных линий меланомы и рака легких, служили в качестве эффективных терапевтических противоопухолевых вакцин на доклинических моделях, когда их вводили только подкожным введением или загружали на дендритные клетки. 17 , Чтобы проверить, может ли введение DRibbles без дендритных клеток привести к перекрестному праймированию антиген-специфических Т-клеток, мышей-переносчиков C57BL / 6 акцептивно перенесли с меченными CFSE наивными T-клетками OT-I и иммунизировали DRibbles, полученными из OVA-экспрессирующих 3LL опухолевые клетки (OVA-DRibbles). Анализ проточной цитометрией T-клеток OT-I в селезенке от вакцинированных мышей показал, что подкожно инъецированные OVA-DRibbles были плохими факторами деления T-клеток OT-I. Процент деления OT-I и процент OT-I среди CD8 T-клеток достигают максимального уровня 40% и 0,4% соответственно, когда подкожно вводят 10-30 мкг DRibbles ( Рис. 1а, б ). Дальнейшего увеличения клеток OT-I не наблюдалось, когда количество DRibbles было увеличено до 300 мкг. Напротив, интранодальное введение 1 мкг DRibbles привело к делению 80% T-клеток OT-I и значительно более высокому проценту T-клеток OT-I в селезенке ( Рис. 1б, в ). Экспансия T-клеток OT-I зависела от дозы DRibble; когда инъекция DRibbles увеличилась с 1 мкг до 10 мкг, удвоение T-клеток OT-I было обнаружено в селезенке через 7 дней после вакцинации (с 2,5 до 5%) ( Рис. 1г ). Когда уровни максимальных уровней активации и расширения Т-клеток сравнивались, интранодальная инъекция (10 мкг) приводила к повышению уровня деления Т-клеток в 20 раз по сравнению с подкожной инъекцией (30 мкг) ( Рис. 1г ). Мы пришли к выводу, что входящий путь превосходит sc-путь для прямого введения вакцин DRibble.

Фигура 1: Влияние пути введения вакцины и костимуляции антителами против ОХ40 на экспансию и дифференцировку Т-клеток.

Чтобы определить наиболее эффективный путь для DRibbles при перекрестном праймировании CD8 + T-клеток, DRibbles, полученные из 3LL-клеток, экспрессирующих антиген OVA, инъецировали в указанных дозах мышам C57BL / 6 с помощью sc или путем инъекции после адоптивного переноса 1 × 106. Меченные CFSE TCR трансгенные Thy1.1 + OT-I T-клетки. Степень пролиферации OT-I оценивали путем окрашивания T-клеток OT-I антителами против CD8, Thy1.1 и Vα2, анализа методом проточной цитометрии разбавления CFSE на 5 день после вакцинации. ( а ) Деление CFSE ( б ) Частота ОТ-I Т-клеток после подкожной инъекции 10 ~ 300 мкг DRibbles. ( c ) деление CFSE и ( d ) частота T-клеток OT-I после инъекции 1 ~ 10 мкг DRibbles. Чтобы исследовать влияние костимуляции против OX40 на экспансию и дифференцировку Т-клеток, вызванную DRibbles, наивные мыши C57BL / 6 были адоптивно перенесены с 10000 спленоцитов от трансгенных мышей Thy1.1 OT-I. OVA-DRibbles 10 мкг вводили в два паховых лимфатических узла и 100 мкг анти-OX40-антитела вводили внутрибрюшинно дважды в 3 дня, в день инъекции DRibble и в день 3. Через семь дней селезенки собирали у контрольных мышей, которые получали усыновление. перенос только T-клеток OT-I, только анти-OX40, только вакцинация против DRibble или комбинация вакцинации против DRibble и анти-OX40. ( e ) Процент T-клеток OT-I определяли анализом проточной цитометрией (анти-CD8, анти-Thy1.1, Vα2). Данные представляют собой среднее и стандартную ошибку среднего для трех мышей на группу. ( f ) Дополнительные антитела против CD127 и KLRG1 использовали для определения фенотипов T-клеток OT-I от разных мышей. График представляет собой типичный результат от одной из трех мышей. Эксперимент был повторен один раз, и были получены аналогичные результаты. * Р <0,05; ** Р <0,01; *** Р <0,001.

Совместная стимуляция анти-OX40 способствовала пролиферации и расширению предшественника памяти (MPEC), переходных клеток, короткоживущих T-клеток памяти (SLEC) и T-клеток памяти

Чтобы проверить гипотезу о том, что совместная стимуляция анти-OX40 может стимулировать вызванную DRibble экспансию Т-клеток, наивные мыши C57BL / 6 получили небольшое количество (1 × 104) наивных конгенных Thy1.1 + OT-I трансгенных Т-клеток для имеют аналогичную частоту эндогенных OVA-специфических Т-клеток до того, как они были вакцинированы OVA-DRibbles с помощью in-route. Анти-ОХ40 (100 мкг) вводили внутрибрюшинно дважды в день вакцинации и на 3 день после вакцинации. Через семь дней после вакцинации процентное содержание Thy1.1 + OT-I T-клеток в селезенке различных групп мышей определяли методом проточной цитометрии с использованием антител против α-цепей Thy1.1 и OT-I TCR. Обработка анти-OX40 привела к приблизительно 5-кратному увеличению процента T-клеток OT-I (с 0,2% до 1,0%) по сравнению с одной только вакцинацией ( Рис. 1е ).

Было хорошо задокументировано, что дифференцировка Т-клеток сочетается с делением Т-клеток, и генерация долговременных Т-клеток памяти наряду с короткоживущими эффекторными клетками является критически важной для опосредованной Т-клетками регрессии опухоли. 21 , 22 , 23 , Таким образом, мы исследовали влияние костимуляции против OX40 на дифференцировку Т-клеток с помощью стратегии двойного стробирования с маркерами поверхности Т-клеток CD127 и KLRG1. В день экспансии пика T-клеток большинство (67%) T-клеток OT-I, управляемых одной только вакцинацией DRibble, окрашивалось положительно на CD127 и отрицательно на KLRG1, что указывает на то, что они были в основном эффекторными клетками предшественника памяти (MPEC). Небольшое количество (22%) ранних эффекторных клеток (EEC), которые потеряли CD127, но не приобрели экспрессию KLRG1, также было индуцировано на этой стадии ( Рис. 1f , левая панель). Обработка анти-OX40 резко изменила эффекторный состав памяти, индуцируя экспрессию KLRG1 ( Рис. 1f правая панель). Хотя большинство ОТ-I Т-клеток на этой стадии все еще были MPEC (56%), 10% из них утратили экспрессию маркера Т-клеток памяти CD127 и получили экспрессию KLRG1- фенотипа, отражающего короткоживущие эффекторные Т-клетки. (SLEC). Интересно, что приблизительно 20% T-клеток OT-I окрашены положительно как для CD127, так и для KLRG1- фенотипа, который не был хорошо охарактеризован и редко наблюдался на T-клетках с долговременной памятью. Эта популяция, вероятно, представляет собой переходные клетки между MPEC и SLEC ( Дополнительный рисунок S1 ). Из-за ограниченного деления Т-клеток одна только вакцинация DRibble в первую очередь индуцирует MEPC. Комбинация с костимуляцией против OX40 не только значительно усиливала индуцированную вакциной пролиферацию CD8 + T-клеток, но также программировала управляемые антигеном T-клетки как в отношении фенотипов памяти, так и эффекторов.

Перекрестное праймирование 4T1-специфических Т-клеток DRibbles, выделенных из аллогенных опухолевых клеток

Перекрестная реактивность иммунного ответа, индуцированного DRibbles, полученного из клеток сингенной саркомы с отчетливой антигенностью, позволяет предположить, что DRibbles может представить скрытые опухолеспецифичные антигены, которые разделяются различными опухолями с одинаковой гистологией 18 , Во-первых, мы попытались определить, наблюдались ли похожие явления при изучении опухолей разного генетического происхождения. В частности, мы спросили, могут ли DRibbles из различных клеточных линий аллогенной карциномы молочной железы индуцировать 4T1-специфические Т-клетки у мышей BALB / c. Селезенки, содержащие примированные к DRibble Т-клетки, собирали через 7-9 дней после интранодальной инъекции DRibbles и повторно стимулировали либо DRT 4B1, пульсированными на наивных клетках селезенки, либо облученными клетками 4T1. Когда CD8 + Т-клетки от мышей, вакцинированных 4T1 DRibbles, были повторно стимулированы 4T1 DRibbles, мы обнаружили, что около 1,5% примированных CD8 + Т-клеток селезенки продуцировали IFN-γ после стимуляции ( Рис. 2а , левая панель). Удивительно, но CD8 + T-клетки, примированные аллогенными MMC или C57MG DRibbles, также генерировали сопоставимый или более высокий ответ (2–3,5%), чем CD8 + T-клетки, примированные аутологичными 4T1 DRibbles (1–2%). Однако когда облученные опухолевые клетки 4T1 использовались для повторной стимуляции примированных эффекторных Т-клеток, аутологичные DRibbles из опухолевых клеток 4T1 и алло-DRibbles, полученные из опухолевых клеток C57MG, праймировали аналогичный уровень 4T1 опухолево-реактивных CD8 + эффекторных Т-клеток (около 0,75% CDN + Т-клетки, продуцирующие IFN-γ) ( Рис. 2а правая панель). Allo-DRibbles из опухолевых клеток MMC также примировали 4T1 опухолевые реактивные CD8 + T-клетки (около 0,5%).

Рисунок 2: Функциональный анализ опухолевых перекрестно-реактивных Т-клеток, вызванных вакциной DRibble vac DRibble и в сочетании с костимуляцией против OX40.

( а ) Наивных мышей BALB / c вакцинировали внутрибрюшинно DRT-блоками 4T1, C57MG и MMC, а спленоциты выделяли через 7 дней после вакцинации и повторно стимулировали либо DRT-блоками 4T1, пульсирующими на наивных АРС селезенки (левая панель), либо непосредственно целыми опухолевыми клетками 4T1 ( правая панель). Продукцию внутриклеточного ИФН-γ после рестимуляции определяли, как описано в разделе метод. Необработанные наивные мыши были использованы в качестве отрицательных контролей. ( b ) То же, что ( а ) с дополнительной внутрибрюшинной инъекцией анти-ОХ40-антитела через 3 и 5 после инъекции DRibble. Мышей, обработанных одним анти-OX40, включали в качестве дополнительного контроля. ( c ) Клетки селезенки от примированных мышей с C57MG DRibbles и анти-OX40 антителом хранили в культуре с полной средой без добавления экзогенного цитокина в течение 5 дней, прежде чем их использовали в качестве эффекторных Т-клеток для измерения эффекторных функций путем внутриклеточного окрашивания и проточной цитометрии. анализ. ( d , e ) Помимо продукции IFN-γ, как свежеизолированные, так и культивируемые CD8 + Т-клетки селезенки были способны продуцировать гранзим А и В при рестимуляции с помощью 4T1 DRibbles или опухолевых клеток. Данные представляют собой среднее значение и стандартную ошибку среднего для трех или четырех мышей на группу. Независимые эксперименты проводились два-три раза. * Р <0,05; ** Р <0,01.

Затем мы также провели комбинаторные эксперименты с вакцинацией DRibble и костимуляцией против OX40. Мышей вакцинировали DRibbles, выделенными из клеточных линий карциномы молочной железы мыши (4T1, C57MG и MMC), и обрабатывали анти-OX40 на 3 и 5 день после интранодальной инъекции вакцин DRibble. Мышей, не получавших лечение, и мышей, получавших только антитело против ОХ40, включали в качестве контроля. Спленоциты выделяли на 9-й день после инъекции вакцины и рестимуляции либо с помощью 4T1 DRibble, пульсирующего на наивных клетках селезенки, в качестве опухолевых клеток APC или 4T1. Обработка антителом против ОХ40 немного увеличивает фоновые ответы клеток селезенки на стимуляцию, 0,5% CD8 + Т-клеток продуцировали IFN-γ при рестимуляции in vitro ( Рис. 2б ). Приблизительно 2% CD8 + T-клеток от мышей получали вакцины DRibble вместе с анти-OX40-антителами, продуцировавшими IFN-γ, после рестимуляции импульсом 4T1 DRibbles на АРС селезенки или целые опухолевые клетки 4T1.

Чтобы продемонстрировать, что перекрестно праймированные Т-клетки DRibble также проявляют эффекторные функции, отличные от IFN-γ, мы провели эксперименты, чтобы определить, могут ли перекрестно-праймированные Т-клетки демонстрировать дополнительные функции эффекта в дополнение к IFN-γ Рис. 2с ). Для этого спленоциты были выделены у мышей, вакцинированных C57MG DRibble плюс анти-OX40, либо стимулировались ex vivo, либо после культивирования в CM без экзогенного цитокина в течение 5 дней с помощью 4T1-DRibbles, пульсирующих на APC селезенки или целых опухолевых клетках 4T1 ( Рис. 2c – e ). Более 70% этих IFN-γ-продуцирующих CD8 T-клеток также продуцировали гранзим A или B, что указывает на то, что они являются типичными эффекторными / запоминающими T-клетками ( Рис. 2г, д ). Подобный функциональный профиль наблюдался, когда Т-клетки селезенки от мышей, получавших 4T1 или MMC DRibbles, были проанализированы (данные не показаны). Вместе мы приходим к выводу, что комбинация либо аутологичных, либо аллогенных вакцин DRibble и анти-OX40 костимуляции является мощной стратегией для индукции функциональных 4T1 опухолево-реактивных CD8 + T-клеток, которые могут опосредовать мощную противоопухолевую эффективность.

Лечение мышей с установленными опухолями 4T1 интранодальным введением аутологичных и аллогенных DRibbles в сочетании с костимуляцией против OX40

Затем мы исследовали эффективность вакцины DRibble с или без костимуляции против OX40 в ортотопической модели рака молочной железы 4T1. Раковые клетки с высокой степенью метастазирования 4T1 были инъецированы непосредственно в области молочных желез, и метастазы могут быть обнаружены в дистальных органах, таких как мозг, легкие, печень и кости, через 7–10 дней после инъекции опухоли. 24 , Чтобы продемонстрировать противоопухолевую эффективность у мышей с прогрессирующим бременем опухоли 4Т1, опухолям 4Т1 позволяли расти в течение 13 дней до начала терапии, когда средний диаметр опухолей достигал 3-5 мм ( Рис. 3а ). Мышей с 13-дневными опухолями 4Т1 делили на разные группы лечения или оставляли без лечения. Приблизительно через 35 дней после инокуляции опухоли все необработанные контрольные мыши должны были быть подвергнуты эвтаназии из-за большой опухолевой нагрузки; мыши, получавшие только вакцинацию против DRibble или анти-OX40, имели ограниченный контроль опухоли ( Рис. 3б ). Комбинация вакцинации DRibble и лечения анти-OX40 показала драматический синергетический эффект на выживаемость мышей. Не только рост опухоли был значительно задержан, но и опухоли были ликвидированы у 60% мышей. Следовательно, средняя выживаемость была значительно улучшена по сравнению с контрольными мышами.

Фигура 3: Комбинация интранодальной инъекции 4T1 DRibbles и анти-OX40 костимуляции индуцировала сильные противоопухолевые иммунные ответы и опосредовала значительную регрессию опухоли и излечение мышей с установленными опухолевыми клетками 4T1.

( а ) Схема стратегии иммунотерапии, которая сочетает интранодальную вакцинацию с DRibbles и костимуляцию с антителом против ОХ40. Раковые клетки 4T1 инъецировали подкожно (20000) в правую жировую подушку молочной железы мышей BALB / c. На 13-й день мыши получали вакцину DRibble (20 мкг, дюйм) с последующими двумя бустерами с DC-нагруженными DRibble (20 мкг / 3 млн. Подкожно) на 15-й и 18-й день. Анти-OX40 вводили внутрибрюшинно сразу после каждой прививки DRibble. в 100 мкг на мышь. ( b ) Вакцинация от DRibble в сочетании с костимуляцией против OX40 привела к значительному регрессу опухоли и излечению 60% обработанных мышей. (c ) Вакцинация от DRibble в сочетании с анти-OX40 значительно увеличила частоту T-клеток CD4 + и CD8 + в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) мышей с опухолями. Кровь собирали на 32 день и PBMC анализировали проточной цитометрией, чтобы определить процентное содержание подгруппы CD4 и CD8 в общем PBMC (CD45 +) после очистки через градиент плотности. Данные представляют собой среднее и стандартную ошибку трех мышей на группу. (d, e) мышей, отвержденных комбинированной вакциной DRibble / анти-OX40, и контрольных мышей, которым не вводили контрольную дозу, заражали 100000 Delta-actA-Lm-AH1-A5 внутривенно. Спленоциты собирали и повторно стимулировали пептидом AH1 неделю спустя. Проводили ICS CDN + T-клеток, продуцирующих IFN-γ. Независимые эксперименты проводились три раза. * Р <0,05; ** Р <0,01.

Чтобы соотнести терапевтическую эффективность комбинированной терапии с иммунными изменениями, мы сначала определили процент общего количества CD8 + и CD4 + T-клеток в периферической крови мышей, получавших вакцину DRibble, антитело против OX40 или комбинацию этих двух агентов. Интересно, что мы обнаружили, что процентное содержание CD8 + и CD4 + T-клеток в крови было значительно увеличено у мышей, получавших антитело против OX40; никаких существенных изменений не было обнаружено у мышей, получавших только вакцину DRibble. Однако комбинация вакцинации против DRibble и анти-OX40-антител еще более увеличила процент CD8 + и CD4 + Т-клеток крови ( Рис. 3с ). Обе анти-OX40 костимуляции могут вызывать антиген-независимую пролиферацию и влиять на поступление Т-клеток эффектора / памяти в кровь из лимфоидных органов. Ожидается, что как антиген-зависимая, так и независимая пролиферация и трафик способствуют значительному увеличению CD8 + в крови и Т-клетки CD4 + у мышей, обработанных вакциной DRibble и антителом против ОХ40.

Для выявления опухолевого антигенспецифического ответа CD8 + T-клеток мышей, которых лечили с помощью DRibble и анти-OX40 терапии, заражали Listeria monocytogenes, экспрессирующими эпитоп AH1, полученный из антигена gp70, который является эндогенным антигеном, экспрессируемым опухолевыми клетками 4T1. Мы измерили способность CD8 + T-клеток селезенки продуцировать IFN-γ в ответ на пептид AH1 ex vivo неделю спустя ( Рис. 3d и е ). Более 10% CD8 + Т-клеток селезенки у мышей, излеченных комбинированной терапией DRibble / OX40, продуцировали IFN-γ при повторной стимуляции пептидом AH1. Однако мало кто из CD8 + T-клеток от необработанных мышей ответил на повторную стимуляцию. Взятые вместе, эти данные предполагают, что аутологичные DRibbles из 4T1 в сочетании с анти-OX40 могут быть использованы для эффективного лечения опухоли молочной железы 4T1 и индуцированных вакциной 4T1 DRibble AH1-специфических Т-клеток.

Затем мы исследовали эффективность аллогенных DRibbles от установленных линий клеток рака молочной железы. С этой целью мы проверили способность алло-DRibbles вызывать первичные терапевтические иммунные ответы против опухолей 4T1 и сравнили их относительную эффективность с аутологичными 4T1 DRibbles у мышей BALB / c с 13-дневными опухолями 4T1 ( Рис. 4а ). Мы обнаружили, что вакцинация алло-DRibbles из опухолевых клеток C57MG приводила к значительной регрессии опухолей 4T1 ( Рис. 4б ). Примечательно, что вакцинация алло-DRibbles C57MG в сочетании с антителом против OX40 привела к тому, что 80% мышей излечились от установленных опухолей 4T1, что значительно выше, чем выживаемость, чем вакцинация с помощью аутологичных DRibbles 4T1 (50%) ( Рис. 4с ). Это указывает на то, что алло-DRibbles могут быть полезны для эффективного лечения опухолей молочной железы. Аналогичный результат был получен с использованием алло-DRibbles, полученных из опухолевых клеток MMC; 60% мышей BALB / c с установленными опухолями 4T1 были излечены обработкой MMC DRibbles плюс введение антитела против OX40 ( Рис. 4d ).

( a ) Чтобы оценить, могут ли алло-DRibbles придать противоопухолевый иммунитет против 4T1, мы вводили алло-DRibbles из клеток карциномы молочной железы C57MG (b, c) или MMC (d) . Мыши BALB / c с 13-дневными опухолями 4T1 были установлены как в Рис 2 и лечили DRibbles от опухолей C57MG, опухолей 4T1, с последующими двумя бустерами с DC sc с 2-дневным интервалом. Анти-ОХ40 (100 мкг) вводили внутрибрюшинно вместе с каждой иммунизацией. Алло-DRibbles C57MG привели к 80% скорости излечения мышей BALB / c с опухолями 4T1. Чтобы определить роль CD4 + или CD8 + T-клеток в противоопухолевой эффективности, опухолевые клетки 4T1 (30000) инъецировали в правые молочные прокладки мышей BALB / c. На 5-й день мышей с пальпируемыми опухолями разделили на четыре экспериментальные группы: необработанные, вакцинация DRibble и анти-OX40, вакцинация DRibble и анти-OX40 с истощением CD8, DRibble и анти-OX40 с истощением CD4. Анти-CD8 (100 мкг) и анти-CD4 (200 мкг) дважды вводили внутрибрюшинно для истощения CD8 + и CD4 + Т-клеток соответственно на 5, 9 день. Мыши получали DRibbles (in, 20 мкг) от опухолей MMC на 6 день. -OX40 (100 мкг) вводили внутрибрюшинно в день 6 и 9. Рост опухоли измеряли через день в рабочие дни, начиная с дня 10 ( c ), и контролировали выживаемость мыши ( d ). Независимые эксперименты проводились два раза. * Р <0,05; ** Р <0,01.

Чтобы оценить роль CD8 + и CD4 + Т-клеток в регрессии опухоли, анти-CD8 или анти-CD4-антитела использовали для истощения соответствующих подмножеств Т-клеток за один день до вакцинации и каждые 3–4 дня после этого для 3 инъекций. Истощение либо CD8 + T-клеток, либо CD4 + T-клеток практически устраняет противоопухолевый эффект комбинированного лечения MMC DRibbles и анти-OX40-антитела ( Рис. 4d ). Наши результаты показывают, что как CD8 +, так и CD4 + T-клетки необходимы для противоопухолевого иммунитета, индуцированного комбинированной иммунотерапией DRibble и anti-OX40. Требование обоих подмножеств Т-клеток не является уникальным для вакцины MMC DRibble. Наши текущие исследования с другими моделями опухолей также показали, что для противоопухолевого эффекта вакцин DRibble требуется одинаковая потребность как CD4, так и CD8 T-клеток. Мы наблюдали аналогичную потребность в CD4 и CD8 T-клетках в экспериментах с легким Line-1 и оральным плоскоклеточным раком SCC-VII (рукописи в процессе подготовки).

SLiP, выделенные из опухолевых клеток, эффективно стимулируют антиген-специфические наивные Т-клетки in vitro

В эукариотических клетках ингибирование протеасом приводит к шунтированию убиквитинированных SLiP в аутофагосомы с помощью убиквитин-связывающих рецепторов p62 и NBR1. 25 , 26 , 27 , Недавно Sims et al . создал синтетический Ub-связывающий белок Vx3 (A7), который содержит несколько тандемных убиквитин-взаимодействующих мотивов (tUIM) со структурированными линкерными участками, которые преимущественно связываются с Lys63-polyUb 28 , Поскольку DRibbles содержат Lys63-polyUb, и в нашей предыдущей публикации была предложена критическая роль p62 в накоплении SLiPs с Lys63-polyUb и иммуногенности DRibbles. 18 мы использовали Vx3 (A7) для выделения убиквитинированных SLiPs из опухолевых клеток. Мы создали слитый белок GFP из Vx3 (A7) и GFP (Vx3GFP) для облегчения как бактериальной экспрессии, так и очистки и функциональной доставки изолированных белков, конъюгированных с polyUb, в антигенпрезентирующие клетки ( Дополнительный рисунок S2A ). После лечения бортезомибом SLX можно было выделить из лизатов целых опухолевых клеток с помощью Vx3GFP ( Дополнительный рисунок S2B ).

OVA-экспрессирующие опухолевые клетки и OT-I TCR-трансгенные T-клетки были впервые использованы для проверки того, могут ли SLiPs стимулировать наивные CD8 + OT-I T-клетки in vitro . SLiPs из клеток меланомы B78H1 стабильно экспрессировали короткоживущий слитый белок GFP-OVA (B78H1-OVA) и нативный GFP (B78H1-GFP). Клетки меланомы B78H1 были использованы здесь, потому что они не экспрессируют классические молекулы MHC-I и не имеют гена TAP2 29 , 30 , Клеточная линия mutu-1940 DC использовалась в качестве APC, а наночастицы оксида алюминия использовались для облегчения внутриклеточной доставки изолированных SLiP. 31 , DC Mutu-1940 представлял собой установленную клеточную линию от трансгенных мышей C57BL / 6 с большим T-антигеном CD1c-SV40. 32 и было показано, что он очень похож на эндогенные CD8 + обычные DC (cDC). Когда меченные CFSE наивные T-клетки OT-I стимулировались DC-мутантами, нагруженными SLiPs, OVA-специфическая пролиферация T-клеток наблюдалась, когда SLiPs очищали от B78H1-OVA, но не от опухолевых клеток B78H1-GFP. Кроме того, ДК, получавшие импульсы с SLiP из нормальной печени, также не могли стимулировать Т-клетки OT-I ( Дополнительный рисунок S3 ). Эти результаты показали, что изолированные SLiP при загрузке в DC могут быть богатым источником антигенов, способных стимулировать антиген-специфическую пролиферацию CD8 + T-клеток.

Помимо антигена gp70, в настоящее время мы не знаем идентичности общих опухолево-ассоциированных антигенов, экспрессируемых клетками опухоли молочной железы 4T1, MMC или C57MG. Тем не менее, наша опубликованная работа показала, что SLiPs, накопленные в DRibbles, были критическими для перекрестной защиты, вызванной саркомой DRibble у мышей C57B6. 18 , Чтобы непосредственно продемонстрировать, могут ли SLiPs индуцировать перекрестно-реактивные Т-клетки, мы выделяем SLiP из опухолевых клеток 4T1, C57MG (H-2b) и CT26 и изучали их способность праймировать ограниченные по MHC I Т-клетки, которые распознают опухолевые клетки 4T1 или CT26 в BALB / c мыши. Мышей BALB / c вакцинировали изолированными SLiPs путем введения без адъюванта. Примированные спленоциты собирали и повторно стимулировали облученными аутологичными клетками опухоли толстой кишки 4Т1 или сингенной СТ26. В соответствии с представлением о том, что SLiPs являются источниками общих антигенов, аналогичный процент примированных CD8 + T-клеток, примированных одним из трех SLiP, ответил на повторную стимуляцию опухоли 4T1 in vitro ( Рис. 5а ). Удивительно, но примированные Т-клетки также реагировали на рестимуляцию облученными клетками опухоли толстой кишки CT26 ( Рис. 5б ). Эти данные также позволяют предположить, что полученные из опухолей SLiP могут перекрестно расщеплять реагирующие на опухоль Т-клетки, чтобы распознавать не только клетки рака молочной железы, но также клетки рака толстой кишки.

Фигура 5: Перекрестное праймирование опухолевых перекрестно-реактивных Т-клеток с использованием SLiP, выделенных из опухолевых клеток с аллогенными или МНС класса Ia.

Чтобы оценить, являются ли выделенные убиквитинированные SLiPs из аллогенных раковых клеток молочной железы (C57MG) или сингенных раковых клеток толстой кишки (CT26), мы вводили выделенные SLiPs из опухолевых клеток путем введения мышам BALB / c. Через семь дней мышей умерщвляли и повторно стимулировали спленоциты клетками 4Т1 или клетками СТ26. Внутриклеточное окрашивание IFN-γ проводили для определения частоты опухолево-реактивных CD8 + T-клеток, индуцированных вакцинацией SLiP. ( а ) CD8 + Т-клеточные ответы на клетки 4Т1. ( б ) CD8 + Т-клеточные ответы на клетки CT26. Чтобы оценить, могут ли SLiP, выделенные из опухолевых клеток, индуцировать опухолево-реактивные Т-клетки, мы вакцинировали мышей C57BL / 6 с SLiP из клеток меланомы B78H1 вместе с наночастицами оксида алюминия (HS) в качестве адъюванта. Мышей, вакцинированных только адъювантом HS или SLiP из нормальной ткани печени плюс HS, включали в качестве контролей. Через семь дней мышей умерщвляли и спленоциты повторно стимулировали облученными опухолевыми клетками B78H1 ( d ), B78H1-Db ( e ), B78H1-Kb ( f ) и B78H1-DbKb ( g ), CM в качестве отрицательного контроля ( c ). Внутриклеточное окрашивание IFN-γ проводили для определения частоты опухолево-реактивных CD8 + T-клеток, индуцированных вакцинацией SLiP. Данные представляют собой среднее и стандартную ошибку среднего для пяти мышей на группу. Независимые эксперименты проводились три раза. * Р <0,05; ** Р <0,01; *** Р <0,001.

Классические ограниченные по МНС I противоопухолевые Т-клетки можно индуцировать in vivo путем иммунизации очищенными SLiP.

Для дальнейшей поддержки гипотезы о том, что изолированные убиквитинированные SLiPs являются хорошим источником антигенов для перекрестного праймирования классических ограниченных по MHC-I опухолево-реактивных T-клеток in vivo , мы обратимся к клеткам меланомы B78H1, в которых отсутствуют молекулы MHC-Ia (H -2Db или H-2Kb). B78H1-Db, B78H1-Kb, B78H1-DbKb стабильные клеточные линии, которые были трансфицированы для стабильной экспрессии молекул H-2, использовали для определения того, ограничены ли эти молекулы MHC-I реактивными в отношении опухолей Т-клетками, индуцированными SLiP. Для этого мышей C57BL / 6 вакцинировали изолированными клетками меланомы B78H1, полученными из SLiPs, вместе с адъювантом из оксида алюминия. Через семь дней после вакцинации SLiPs спленоциты повторно стимулировали облученными клетками B78H1, B78H1-Db, B78H1-Kb и B78H1-DbKb, чтобы определить, могут ли T-клетки, примированные изолированными SLiPs, распознавать опухолевые клетки B78H1 с помощью внутриклеточного анализа высвобождения IFN-γ и потока анализ цитометрии. Опухолевые клетки B78H1, которые экспрессируют H-2Db, Kb или оба, но не родительские опухолевые клетки B78H1, могут стимулировать Т-клетки от мышей, примированных SLiPs ( Рис. 5c – g ). В качестве дополнительного контроля мышей также вакцинировали SLiP, полученными из нормальной печени или только с адъювантом из оксида алюминия. Т-клетки от наивных мышей, мыши получали нормальные SLiPs почек или мыши, получавшие только адъювант, не реагировали на стимуляцию in vitro опухолевыми клетками. Эти данные ясно показали, что убиквитинированные SLiPs, выделенные из опухолевых клеток с дефицитом MHC-Ia, могут перекрестно расщеплять ограниченные по MHC-Ia CD8 + T-клетки in vivo .

Похожие

Комментарии